人-软骨组织单细胞悬液制备
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注 | 以上操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考，实际应用过程中请根据具体情况进行细节上的调整
软骨组织
软骨是以支持作用为主的结缔组织。软骨内不含血管和淋巴管，软骨组织由软骨细胞和软骨基质构成， 软骨基质是软骨细胞的细胞外基质，根据软骨基质内含纤维的不同，可将软骨组织分为透明软骨、弹性软骨、纤维软骨3种。
透明软骨分布较广，主要分布于关节软骨、肋软骨等。软骨基质由无定形基质和包埋在基质内的胶原原纤维构成，无定型基质中主要含3种糖胺聚糖：聚透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素。透明软骨中的纤维是由II型胶原蛋白组成的胶原原纤维，含量约占软骨干重的40%，此外，在基质中还含有少量其他胶原蛋白，如VI、IX、X、XI型胶原。软骨基质中的小腔为软骨陷窝，软骨细胞即位于此陷窝内，软骨细胞周基质中含VI型胶原蛋白组成的细网丝。
纤维软骨分布于椎间盘、关节盘及耻骨联合等处。基质内富含胶原纤维束，呈平行或交错排列，化学成分为I型胶原蛋白，也含不等量II型胶原原纤维，无定型基质很少，其中以多功能蛋白聚糖为主。软骨细胞较小而少，成行排列于胶原纤维束之间。
弹性软骨分布于耳廓及会厌等处。结构类似透明软骨，仅在间质中含有大量交织成网的弹性纤维，胶原纤维较少，具有较强弹性。
综上，软骨基质中主要为胶原蛋白，因此，解离过程中，选择胶原酶进行解离。胶原酶提供广泛的蛋白水解活性，能够降解天然胶原和网状纤维，且优先切割细胞膜外的蛋白，基本上可保持细胞完整。
材料和试剂耗材
1、试剂、仪器耗材
2、酶溶液配制
在标准培养基中配制胶原酶溶液 (1mg/mL)，使其溶解并通过0.45μm和0.2μm注射器过滤器进行无菌过滤。0.45μm过滤步骤对于实现高效过滤至关重要。
胶原酶混合物可以新鲜使用或立即冷冻，制备后最多可使用6个月。分装储存，因为冻融循环会失去活性。
实验流程
在PBS中晃动1 min，清洗切割的软骨组织，并重复几次洗涤步骤。
将切骨的软骨组织放在培养皿上，并使用干净的手术刀从软骨表面刮掉残留的血液或非软骨组织。
沿骨头平切，从骨头表面去除软骨片，放入培养皿标准培养基中。使用手术刀将软骨片（浸在培养基中）切成约 3 mm×3 mm厚度的小块。
将软骨碎块转移至50 mL管中，管中加入胶原酶消化混合物（10 % v/v 软骨：消化混合物），在37°C振荡（45-60 rpm）孵育软骨-胶原酶混合物12-15 h。
消化完成后，将离心管至于冰上，将混合物通过70 μm细胞筛过滤。并用预冷培养基清洗滤网。
300g ，4℃离心5 min。
使用预冷的培养基洗涤沉淀，重悬，并重复离心步骤。
在1mL预冷的缓冲液中重悬细胞，直至沉淀完全重悬。并通过移液吹打彻底混合。
质检，计数细胞并使用台盼蓝检验细胞活力。
如有较多红细胞，则需再做裂解红细胞处理：
重悬细胞沉淀，加入2 mL红细胞裂解液，室温下裂解2 min，以去除剩余红细胞。
加入10 mL预冷的缓冲液抑制红细胞裂解液的活性。
4℃，500g下离心5 min。
重悬于1 mL预冷的缓冲液中并计数，使用台盼蓝评估细胞活力并计数。
质检合格后，稀释到适当浓度，进行上机。
结果展示
所获细胞悬液：活率大于97 %，结团率低，背景干净。
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